大豆种子中菜豆荚斑驳病毒的RT-LAMP检测和大豆花叶病毒表达载体的构建

【摘要】大豆是一种富含优质蛋白、无胆固醇油脂、多种糖类碳水化合物和微量物质的杂粮作物,是饲料、油料和蛋白质的重要来源,也是用地、养地和保持生态平衡的重要作物。本研究以大豆为中心,在大豆上开展病毒病快速检测技术的研究和植物病毒表达载体的构建以用于大豆病害的防预和基因功能的研究。BPMV的RT-LAMP检测：菜豆荚斑驳病毒(Beanpodmottlevirus,BPMV)是一种广泛分布于大豆产区且易造成经济损失的灾害性病毒,在我国被列为检疫性病毒。本研究将RT-LAMP技术和RNA快速抽提法相结合,建立一种用于检测大豆种子中BPMV的一步法RT-LAMP检测技术。该技术包括所设计的引物和优化过的反应体系。经过测试,该技术能够在大豆种子中快速、特异、准确地检测出BPMV且无交叉反应;其最适工作温度为62.5-65℃可工作模板剂量范围为0.2-1.8μL/10μL;灵敏度为BPMVRT-PCR的1000倍。因此,该技术可以作为BPMV检验检疫以及预防BPMV大规模爆发的有效工具。SMV表达载体的构建：尽管已有一些不同株系的大豆花叶病毒(Soybeanmosaicvirus,SMV)表达载体被报道,但是这些SMV的基因组全长都是9585bp左右,目前还没有基因组全长为9994bp左右的重组型SMV被构建成表达载体。这种重组型SMV是2011年在南京被鉴定,其基因组5’端与菜豆普通花叶病毒(Beancommonmosaicvirus,BCMV)的5’端发生过重组,因此在5’端与普通SMV的5’端有较大的差异,而在3’端差异较小。本研究将重组型SMV的5’端与普通SMV的3’端进行拼接,构建出一个嵌合式重组型SMV表达载体。并在该SMV的P1和HcPro间插入β-葡萄糖醛酸酶基因(GUS),通过质粒摩擦接种大豆30天后,在接种大豆的系统叶上特异地检测到GUS染色,同时通过农杆菌介导的方式注射本氏烟,在接种本氏烟的系统叶上也特异地检测到GUS染色。因此,本研究中所构建的嵌合式重组型SMV表达载体可以作为基因功能研究工具在大豆、本氏烟及其病原物的基因功能研究以及获取外源目的蛋白等方面发挥其潜在的应用价值。本研究成功建立一步法BPMVRT-LAMP检测技术和SMV表达载体系统,为大豆病害预防和基因功能研究提供出新的技术和工具。
【作者】卫其巍；
【导师】窦道龙；
【作者基本信息】南京农业大学，植物病理学，2013，硕士
【关键词】大豆；菜豆荚斑驳病毒；PT-LAMP；大豆花叶病毒；表达载体；本氏烟；

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